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改良Lowry法蛋白定量試劑盒改良 Lowry 法蛋白定量試劑盒1000 次說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)步驟
(1)實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5)::異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚::異戊醇(25:24:1)抽提兩次,異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量
(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
改良 Lowry 法蛋白定量試劑盒1000 次說(shuō)明書(shū)注意事項(xiàng)
1) 由于細(xì)胞凋亡是一個(gè)快速的過(guò)程，建議樣品在染色后1小時(shí)之內(nèi)進(jìn)行分析。
2) 對(duì)于貼壁細(xì)胞，消化是一個(gè)關(guān)鍵步驟。貼壁細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)如有漂浮細(xì)胞，需收集漂浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞后合并染色。處理貼壁細(xì)胞時(shí)要小心操作，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。胰酶消化時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，PI攝入過(guò)多；消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞膜同樣易造成損傷，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合。消化時(shí)將胰酶鋪滿(mǎn)孔板底后，輕搖時(shí)胰酶與細(xì)胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時(shí)間，待細(xì)胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會(huì)影響Annexin V與PS的結(jié)合。
3) 實(shí)驗(yàn)中如需要固定細(xì)胞，比如在檢測(cè)凋亡的同時(shí)檢測(cè)細(xì)胞周期，只能選用Annexin V-FITC，而不能選用Annexin V-EGFP，因?yàn)樵诠潭ㄟ^(guò)程中EGFP會(huì)變性導(dǎo)致喪失激發(fā)熒光的能力。固定前需要先將細(xì)胞與Annexin V-FITC進(jìn)行孵育，并用binding buffer洗掉未結(jié)合的Annexin V-FITC。因?yàn)楣潭ㄟ^(guò)程中細(xì)胞通透性增加會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞碎片，可以和Annexin V結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
4) 如果樣品來(lái)源于血液，請(qǐng)務(wù)必除去血液中的血小板。因?yàn)檠“搴?/span>PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果?？梢允褂煤?/span>EDTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。
5) 試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)液體灑落。
6) Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時(shí)請(qǐng)注意避光。

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